L’orto botanico conserva in situ, studia e coltiva specie e comunità vegetali. Custodisce più di 50.000 reperti musealizzati, in buona parte campioni storici. La sezione di Città Alta è dedicata alla flora, non solo autoctona, ma anche italiana e di altri continenti. Da maggio 2015 l’Orto si è arricchito della sezione Valle della Biodiversità nei pressi del monastero di Astino, con oltre 1200 varietà di piante alimentari dall’Italia e dal mondo.

L'Orto Botanico di Bergamo "Lorenzo Rota" è stato riconosciuto come Museo nel 2004.

Le sedi di Città Alta si trovano all'interno del sito UNESCO "Opere di difesa veneziane del XVI e XVII secolo". L'Orto fa parte della Rete degli Orti Botanici della Lombardia.