Costituita nel 1618 per volontà di Federico Borromeo, che voleva potesse essere di sussidio e di modello a una futura Accademia di belle arti, per favorire la formazione e l’educazione del gusto estetico, in conformità ai canoni del Concilio di Trento. Conserva capolavori come il Ritratto di musico di Leonardo da Vinci, la Canestra di frutta del Caravaggio, la Madonna del Padiglione di Botticelli e il Codice Atlantico di Leonardo da Vinci, composto di circa 1750 disegni.

La Pinacoteca Ambrosiana è stata riconosciuta da Regione Lombardia come Museo provvisoriamente nel 2004, definitivamente nel 2007.

Il ricco patrimonio conservato all'interno della Pinacoteca è catalogato in Lombardia Beni Culturali.